目前，將質粒 ＤＮＡ 導入動物細胞的方法有很 多，最常用的方法包括脂質體轉染、電轉法、顯微 注射法和磷酸鈣共沉淀法等。雖然脂質體轉染方 法已經普遍使用，且具有性質穩定和轉染效率高等 優點，但是價格較為昂貴；而磷酸鈣轉染的方法使 用成本較低，對具體體系加以優化后，能夠達到較 好的轉染效率，特別是對于２９３Ｔ 細胞來說，與脂 質體的轉染效率無明顯差異。隨著慢病毒感染技 術的進一步發展，各種分子生物學技術及基因技術 的改進，生命科學研究領域越來越多地應用到慢病 毒包裝技術，因此，建立起經濟高效的２９３Ｔ 細胞 的轉 染 方 法 至 關 重 要。１９７３ 年，ＧＲＡＨＡＭ 等首次報道磷酸鈣轉染法。

１ 材料與方法

１．１ 載體、細胞、主要試劑和儀器

反轉錄病毒 表達 載 體 ｐＣＤＨ－ＧＦＰ－３ｘｆｌａｇ－ＴＲＡＦ６ 由 本 實 驗 室 構建保存；人胚腎細胞２９３Ｔ 由福建醫科大學消化 道 腫 瘤 重 點 實 驗 室 提 供；ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、 Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ 培養基和胎牛血清 （美國 Ｇｉｂｃｏ公司）， ＮａＣｌ ［上海國藥 （集團）化學試劑有限公司］，葡 萄糖和 ＫＣｌ２ ［中國 醫 藥 （集 團）上 海 化 學 試 劑 公 司］，ＣａＣｌ２ ·２Ｈ２Ｏ 和 Ｎａ２ＨＰＯ４ ·１２Ｈ２Ｏ ［生 物 工程 （上 海 ） 股 份 有 限 公 司 ］，ＨＥＰＥＳ （臺 灣 ＶＷＲ 公 司）， 單 抗 兔 抗 ｆｌａｇ 單 克 隆 抗 體 （１∶ １０００，中 國 ＢＯＳＩＳ 公 司 ）， 單 抗 小 鼠 抗 β－ａｃｔｉｎ （１∶２０００，美國 ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ 公 司）。凝 膠 成 像 系統購于英國Ｓｙｎｇｅｎｅ公司，無菌潔凈工作臺購于 蘇州凈 化 設 備 有 限 公 司，ＳＨＰ－１５０型生化培養箱購于上海精宏實驗設備有限公司，ＺＥＩＳＳ Ａｘｉｏｃａｍ５１２ 倒 置 熒 光 顯 微 鏡 購 于 德 國 Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ公司。

１．２ 細 胞 培 養

用 ＤＭＥＭ 培 養 基， 并 添 加 １０％胎 牛血 清，在 ３７℃、５％ＣＯ２ 培養 箱 中 培 養 ２９３Ｔ 細胞。轉染 前 １ｄ２９３Ｔ 細 胞 傳 代，重 新 種 板，轉染前細胞匯合度為４０％～６０％。

１．３ 質粒來源和轉染效率的計算

本課題組構建 了 ｐＣＤＨ－ＧＦＰ－３ｘｆｌａｇ－ＴＲＡＦ６ 質 粒，由 于 質 粒 能 夠編碼 ＧＦＰ蛋白，該蛋白在熒光顯微鏡下能夠被 激發出綠色熒光，可以作為比較轉染效率的計數標 志。熒光顯微鏡下觀察轉染２４和４８ｈ后 ２９３Ｔ 細 胞編碼綠色熒光蛋白的細胞數目，計算其占相同視 野下總 的 ２９３Ｔ 細 胞 數 目 的 百 分 率，即 為 轉 染 效 率。

１．４ 傳統磷酸鈣轉染法轉染

２９３Ｔ 細胞 轉 染 前 １ｈ換新 鮮 無 血 清 培 養 基，在５ｍＬ 的圓 底 試 管 底 部加入２５μＬ摩爾濃度為 ２．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ＣａＣｌ２水 溶液 和 ２μｇｐＣＤＨ－ＧＦＰ－３ｘｆｌａｇ－ＴＲＡＦ６ 質粒，加入無菌水 至２２０μＬ，小心 混 勻，且在劇烈吹打下 加入２２０μＬ ＨＥＰＥＳ緩沖 液；圓底試管垂直放在 混旋 器 上 混 旋１０ｓ，室溫 靜 置３０ｍｉｎ；逐滴 加 入 ２９３Ｔ 細胞，輕輕 晃 動 混 勻；８～１２ｈ 換含 血 清 培 養基，轉染２４和４８ｈ后熒光顯微鏡下觀察綠色熒 光。相同方法處理ｐＣＤＨ－ＧＦＰ－ｖｅｃｔｏｒ質粒。

１．５ 改良磷酸

鈣 轉 染 法 轉 染２９３Ｔ 細胞 轉 染 前 １ｈ２９３Ｔ 細胞更 換３７℃預熱 的 無 血 清 培 養 基，在 １．５ｍＬＥＰ管中加入２２０μＬ無菌水；在水中央加 入 ２μｇｐＣＤＨ－ＧＦＰ－３ｘｆｌａｇ－ＴＲＡＦ６ 質 粒；２５μＬ 摩爾濃度為２．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１的 ＣａＣｌ２水溶液小心地 加到 ＥＰ管的 底 部，沿 管 壁 小 心 逐 滴 加 入２５０μＬ ＨＥＰＥＳ緩沖液至液面；在 ＣａＣｌ２ 與上 層 溶 液 之 間 形成的分層處，用２００μＬ 移液槍輕柔吹打，擾亂 分界；室溫放置３０ｍｉｎ；逐滴加入２９３Ｔ 細胞，輕 輕晃動混勻；８～１２ｈ換含血清培養基，２４和４８ｈ 后熒 光 顯 微 鏡 下 觀 察 綠 色 熒 光。相 同 方 法 處 理 ｐＣＤＨ－ＧＦＰ－ｖｅｃｔｏｒ質粒。

２ 結 果

轉染２４和４８ｈ后，與傳統磷酸鈣轉染法 （４９．３％± ７．０２％和６４．７％ ±１１．９％）比較，改 良 磷 酸 鈣 轉 染 法 轉 染 效 率 （６９．３％ ±８．０２％ 和 ９４．３％ ± ５．０３％）明 顯 升 高 （Ｐ ＜０．０５）。轉染２４和４８ｈ后，改良磷酸鈣轉染 法轉染２９３Ｔ 細胞中 ＴＲＡＦ６ｍＲＮＡ 表達水平明顯 高于傳統磷酸鈣轉染法 （Ｐ＜０．０１）。轉染２４和 ４８ｈ 后，改良磷酸鈣轉染法轉染 ２９３Ｔ 細胞中ｆｌａｇ蛋白表達水平明顯高于傳統磷酸 鈣轉染法 （Ｐ＜０．０１）。

３ 討 論

影響磷酸鈣轉染法轉染效率的因素很多，如試 劑配置的濃度和ｐＨ 值等，因此本研究嚴格掌 握實驗試劑的配置方法，特別是ｐＨ 值的大小和試 劑 的 劑 量 要 求 。轉染操作步驟嚴格按照參考文獻和本研究步 驟。操 作 的 不 同 點：

①傳 統 法 要求混旋操作步驟，而本研究的操作步驟無混旋；
②本研究操作只要求普通的 ＥＰ管，傳統法要求用 圓 底 試 管；
③ ２ 種 方 法 在 質 粒 ＤＮＡ、 Ｈ２Ｏ、 ＨＥＰＥＳ和 ＣａＣｌ２ 的 加 樣 方 法 中 存 在 差 別。轉 染 ２４和４８ｈ 后熒光顯微鏡觀察顯示：傳統磷酸鈣轉 染法轉染效率明顯低于改良磷酸鈣轉染法轉染效率，表明改良的磷酸鈣轉染法效率更高。