炎癥性腸病( inflammatory bowel disease，IBD) 是一 種累及回腸、直腸、結(jié)腸的特發(fā)性、慢性和復(fù)發(fā)性腸道 炎癥性疾病，包括克羅恩病( Crohn’s disease，CD) 和 潰瘍性結(jié)腸炎( ulcerative colitis，UC) ，多見于青壯年。 臨床表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、血便、體質(zhì)量減輕等。IBD 過 去多見于西方發(fā)達(dá)國家，近年來，亞洲地區(qū)發(fā)病率呈上 升趨勢，流行病學(xué)研究顯示我國炎癥性腸病的發(fā)病率 高達(dá) 3．44%，居亞洲之首。

1 材料與方法

1．1 實驗動物

雄性 C57BL /6J 小鼠 24 只，6 ～ 8 周 齡，體質(zhì)量( 22±2) g，購自湖北省實驗動物研究中心， 實驗動物生產(chǎn)許可證號: SCXK( 鄂) 2015-0018。飼養(yǎng) 于華中科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院動物房，動物飼 養(yǎng)環(huán)境溫度為 ( 22±2) ℃，相對濕度為 ( 50±5) %。

1．2 藥物及試劑

茜草藤，2014 年 9 月采于陜西省漢 中地區(qū)，經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院張勇慧教授鑒定為茜草的地上部分，標(biāo)本存放于華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，編號為: NP2014100703。葡聚糖 硫酸鈉( DSS) 相對分子質(zhì)量為 35 000 ～ 50 000( 美國 MP 公司，批號: 160110) 。小鼠白細(xì)胞介素( IL) -1β、 腫瘤壞死因子-α( TNF-α) 、干擾素-γ( IFN-γ) 酶聯(lián)免 疫吸附測定( ELISA) 試劑盒( Elk biotechnology 公司， 批號分別為 ELK1271，ELK1395，ELK1132) 。

1．3 儀器

酶標(biāo)儀( Diatek 公司，型號: DＲ-200Bs) ，恒 溫培 養(yǎng) 箱 ( 上海精宏實驗設(shè)備有限公司，型 號: GNP9160) ，制冰機(jī)( 常熟市雪科電器有限公司，型號: IMS-20) 。

1．4 實驗分組

將 24 只 C57BL /6J 小鼠采用體質(zhì)量 分層隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組，模型對照組，茜草 藤大、小劑量組，每組 6 只。

1．5 茜草藤水提物的制備

稱取粉碎后的茜草藤 1000 g，加水至沒過藥材，浸泡 30 min，煎煮 1 h，將水 煎液轉(zhuǎn)移，再加水至沒過藥材，煎煮 1 h，合并水煎液， 靜置 2 h，依次用脫脂棉、濾紙濾過。將濾過液置旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)儀中減壓濃縮( 溫度 65 ℃ ) ，將濃縮至約1000 mL 的水煎液放置－20 ℃冰箱保存，待用。

1．6 造模方法及藥物干預(yù)

茜草藤大、小劑量組分別 預(yù)防性灌胃茜草藤提取物 4．8，1．2 g·kg－1 ，預(yù)防性給 予 3 d，空白對照組和模型對照組灌胃等體積純化水; 模型對照組和茜草藤大、小劑量組分別給予 3% DSS 溶液造模，自由飲用，連續(xù)飲用 7 d，空白對照組小鼠 給予純化水飲用，直到實驗第 10 天。小鼠灌胃藥物， 給藥體積為 20 mL·kg－1 ，每天 1 次，空白對照組小鼠 給予純化水。

1．7 疾病活動度評分

造模前、造模后和給藥后分別 觀察小鼠精神及活動狀況，每天記錄小鼠體質(zhì)量變 化、大便性狀及便血情況，計算疾病活動指數(shù)( disease activity index，DAI) 。體質(zhì)量變化 ( %) = ( 造模后體 質(zhì)量－造模前體質(zhì)量) /造模前體質(zhì)量×100%。評分如 下，①0 分: 體質(zhì)量無變化，大便正常，無便血; ②1 分: 體質(zhì)量變化 1% ～5%，便軟，成型，有便血點; ③2 分: 體 質(zhì)量變化 5% ～10%，大便有黏液，成型，成塊便血; ④3 分: 體質(zhì)量變化 10% ～ 15%，便軟，有黏液，成型，成片 的便血; ⑤4 分: 體質(zhì)量變化 15% ～20%，便軟，有黏液， 不成型，便血及肛門腫脹。

1． 8 樣 本 采 集 實 驗

結(jié) 束 后，眼 球 取 血，以3500 r·min－1 離心 10 min，取上層血清、分裝，然后放 置－80 ℃冰箱備用; 剖腹后，摘取小鼠脾臟，測量脾臟 長度及稱定脾臟質(zhì)量，脾臟指數(shù) = 脾臟總質(zhì)量( mg) / 小鼠質(zhì)量( g) ; 剪取距肛門以上 2 cm 結(jié)腸，取病變最 明顯處結(jié)腸組織于 4%多聚甲醛中，留作病理切片及 免疫組化，再取結(jié)腸組織若干移至－80℃冰箱備用。

1．9 蘇木精-伊紅( HE) 染色檢測

按常規(guī)包埋、切 片，厚度為 4 μm，進(jìn)行 HE 染色，高倍顯微鏡下選取視 野，根據(jù)潰瘍大小、炎癥浸潤和結(jié)構(gòu)損傷程度等進(jìn)行結(jié) 腸組織病變損傷程度統(tǒng)計和比較，組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)如 下，①炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度，0 分: 無，1 分: 輕微的，2 分: 中等的，3 分，嚴(yán)重的; ②炎性反應(yīng)范圍，0 分: 無，1 分: 黏膜，2 分: 黏膜和黏膜下層，3 分，透壁的; ③隱窩破壞 程度，0 分: 無，1 分: 1 /3 破壞，2 分: 2 /3 破壞，3 分，隱 窩消失伴上皮細(xì)胞出現(xiàn)，4 分: 隱窩及上皮細(xì)胞均消失。

2 結(jié)果

茜草藤對 DSS 誘導(dǎo)的 UC 小鼠的 體質(zhì)量影響見圖 1。空白對照組小鼠在實驗期間體質(zhì) 量均上升，一般狀態(tài)良好。小鼠飲用含 3%DSS 飲用水 后，3 組小鼠體質(zhì)量均不同程度下降。實驗第 7 天，與 正常對照組比較，模型對照組體質(zhì)量明顯減少( P ＜ 0．01) ，模型對照組在實驗第 7 ～ 10 天體質(zhì)量均下降， 且第 9 和第 10 天下降最明顯。茜草藤大、小劑量組體 質(zhì)量均較模型對照組偏高，第 8 天，與模型對照組比較 差異有統(tǒng)計學(xué)意義( 均 P＜0．05) 。

茜草藤對 DSS 誘導(dǎo)的 UC 小鼠 DAI 評 分見圖 2。空白對照組小鼠體質(zhì)量有所增加，大便硬度 適中，黑褐色，橢圓形，無稀便及血便，故其 DAI 評分主 要是其體質(zhì)量波動評分。模型對照組小鼠飲用 3%DSS4 d 后，大便性狀開始變化，先是成形大便，然后逐漸變 為稀松大便，甚至是水樣瀉，第 5 天部分小鼠出現(xiàn)血便， DAI 評分顯著升高; 茜草藤大、小劑量組小鼠在造模后 也出現(xiàn)體質(zhì)量降低、大便性狀改變，以及腹瀉、血便等癥 狀，但癥狀明顯比模型對照組輕。與空白對照組比較， 模型對照組小鼠在第 5 天 DAI 評分均顯著升高，差異有 統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0．01) ，茜草藤大、小劑量組 DAI 評分也 升高，但造模后 DAI 評分均低于模型對照組，第 6 天 DAI 評分顯著低于模型對照組( P＜0．05) 。

3 討論

UC 是目前重點研究的一種慢性疾病，UC 模型的 建立是研究生理病理工作的第一步，目前常用于 UC 基礎(chǔ)藥物研究的造模方法為化學(xué)誘導(dǎo)法，其中 DSS 誘 導(dǎo)的模型是最廣泛使用的模型。因此本課題組選 擇 DSS 誘導(dǎo) UC 模型進(jìn)行實驗研究，以評價茜草藤水 提物對 UC 的預(yù)防作用。